【***** 使用手冊】液相色譜柱的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時， 經(jīng)過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。　　加裝保護柱　　保護柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學“垃圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動相吸入口、進樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器，但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學污然，因此，加裝保護柱是必要的，特別是在分析中藥、中成藥等復雜混合物和生物樣品時更是保護分析柱必不可少的措施?！　”Ｗo柱填料應與分析柱一致，粒徑可較分析柱大。保護柱屬消耗品，經(jīng)過**次數(shù)的樣品分析(50～100次)后，出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時，應考慮更換保護柱?！　∵^濾流動相和樣品　　流動相通常由水或緩沖溶液與有機溶劑混合而成，原則上，所有經(jīng)過色譜柱的流動相均應過濾，但在實際操作上應視具體情況而有所區(qū)別：當有機溶劑用色譜純級，水用石英亞沸水或其它超純水時，在能確保水和有機溶劑的質(zhì)量且沒有受到污染時，過濾并無更多實際意義?！　‘斄鲃酉嘀泻芯彌_鹽時，則過濾是必要的，如前所述，當緩沖溶液放置一段時間(視環(huán)境溫度不同而異，夏季一般不超過48 h，冬季一般不超過一周)后，在使用前還應重新過濾?！　∷渲频臉悠吩囈涸谧⑷肓髀废到y(tǒng)前均要經(jīng)0. 45μm(0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系，二者不可混用，以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換，以避免濾器因過載而起不到過濾作用?！　艋瘶悠贰　‘敇悠分泻袑ιV柱有損害的化學成分，如產(chǎn)生*性吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機分子和強吸附性物質(zhì)，以及可能對柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團離子。在進樣前應盡可能對樣品進行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分?！　”苊膺^高的柱壓　　雖然液相色譜柱能耐受的壓力可達6000psi(磅/平方英寸) ，但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命，避免的方法是　　(1)柱壓過高時，盡可能采用較小的流速，以不超過柱大允許壓力的一半為宜。　　(2)當流速較大時，應采取流速梯度的辦法使流速分步到位?！　?3)使用手動進樣閥時，進樣閥的切換要盡可能的快。否則超過20%的壓力沖擊會很快使柱報廢。當使用多柱聯(lián)用時，柱切換要避免在高壓下進行?！　∽⒁鉁囟群退釅A度　　一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱高使用溫度不超過60℃，以低于40℃為宜，特別是在流動相pH接近使用限度時，更應降低使用溫度。溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而，使填料性質(zhì)改變，柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。目前的鍵合硅膠色譜柱標示的pH適用范圍可達2～10，但在實際使用時應避免**的pH條件，特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用，如必須要在**的pH條件下使用時，可通過以下方法避免柱損害：　　(1)在泵和進樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來飽和流動相；　　(2)降低使用溫度；　　(3)檢驗完畢后立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”**清洗?！　≌_及時的沖洗　　開始試驗前，應了解柱中當前是何種溶劑。對于新色譜柱，如無特殊說明均為評價報告中所用流動相。柱中當前溶劑**要與分析樣品所用流動相互溶，如不能混溶，要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是*能與各種溶劑混溶的試劑，可作為中介流動相使用。反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇，如分析用流動相為緩沖液2有機溶劑，可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇，再進分析用流動相，以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀；試驗結(jié)束后，要及時用適當?shù)娜軇_洗系統(tǒng)并終過渡到純甲醇沖洗，對于含有緩沖鹽的流動相，辦法是先用與分析用流動相組成**相同但不含緩沖鹽的溶液進行沖洗，再逐步過渡到純甲醇沖洗。多數(shù)報道沖洗液體積大約為柱容積的15～20倍，但終要以基線是否平直、壓力是否穩(wěn)定決定。有些廠家的色譜柱標明了流動相中有機相的低使用濃度為≥5% ，使用時應給予注意。 液相色譜圖異常的問題、原因與解決方法

　　液相色譜中的許多問題都能在譜圖上反映出來，其中有一些問題可以通過改變設備參數(shù)得到解決；而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。對于色譜柱和流動相的正確選擇是得到好的色譜圖的關鍵。而面對常常發(fā)現(xiàn)的HPLC譜圖異常的問題，如何做到真正解決問題，則需堅持這幾個原則：一具體問題具體對待原則：二先外設后內(nèi)部原則：三由簡而繁原則：四單一處理到綜全處理原則。

　　一、拖尾峰

　　1、篩板阻塞:柱子兩頭的過濾篩板如果堵塞，樣品就會在篩板部分受阻而形成時間延遲，使得樣品在柱后流出時峰型形成拖尾。需要通過反沖色譜柱，或者更換篩板。

　　2、色譜柱塌陷:是指色譜柱由于其它原因引起了柱效率喪失，不能對物質(zhì)形成保留，使得物質(zhì)不在固定相上保留而隨流動相流出，但是又還有一點柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色譜柱或者更換色譜柱。

　　3、有污染:即樣品不在同一起跑線起跑，從后面開始跑得到達終點稍晚，表現(xiàn)出拖尾。更換色譜柱或者采用有機溶劑梯度洗脫1h以上，以沖洗柱子。

　　4、流動相PH值選擇錯誤:如某PH下有的樣品存在分子型和離子型的動態(tài)平衡，離子型的陸續(xù)向分子型轉(zhuǎn)化就會表現(xiàn)出拖尾。調(diào)節(jié)PH值可抑制分子解離，改善拖尾，對于堿性化合物，相對較低的PH值更有利于得到對稱峰。

　　二、前沿峰

　　1、樣品過載:被保留的樣品在正常出峰時間前陸續(xù)出來，形成前沿峰。降低樣品含量。

　　2、樣品溶劑選擇不恰當:當樣品溶劑的洗脫能力大大強于流動相時會出現(xiàn)前沿峰，例如，在反相色譜中用已腈做樣品溶劑，而流動相的洗脫力較弱時會出現(xiàn)前沿峰。選擇流動相或者接近流動相的比例作為樣品溶劑。

　　3、色譜柱損壞:色譜柱柱效損失，不能對物質(zhì)形成保留。更換色譜柱。

　　4、假象前沿峰:在大峰前有小峰出現(xiàn),假象前沿峰，即大峰前包埋了沒有分開的小峰。調(diào)整流動相洗脫梯度。

　　三、基線漂移

　　1、柱溫波動:即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動，通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。使用柱溫箱，控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器。

　　2、流動相不均勻:流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移。使用HPLC級的溶劑，流動相在使用前進行脫氣處理。

　　3、流通池被污染或有氣體:用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。

　　4、流動相配比不當或流速變化:更改配比或流速，為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

　　5、樣品中有強保留的物質(zhì):以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。

　　四、出現(xiàn)寬峰

　　1、塔板數(shù)降低:色譜柱污染或失效，造成塔板數(shù)降低。更換同樣類型的色譜柱，如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強溶劑沖洗舊柱子。

　　2、管路太長或管路內(nèi)徑太大:柱子與檢測器之間的管路太長或管路內(nèi)徑太大。更換內(nèi)徑較小的短管路。

　　3、檢測器響應過大:檢測器對反應時間或池體積響應過大。減少響應時間或使用更小的流通池。

　　五、基線噪音

　　1、尖銳峰:在流動相、檢測器或泵中有空氣。流動相脫氣，沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。

　　2、漏液:檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

　　3、流動相混合不**:用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

　　4、溫度影響:柱溫過高，檢測器未加熱。使用柱溫箱，減少溫度差異或加上熱交換器。

　　5、偶然噪聲:在同一條線上有其他電子設備，斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。采用精密級穩(wěn)壓電源。

　　六、分離度不夠

　　1、流動相梯度洗脫設置不合理:優(yōu)化梯度洗脫程序。

　　2、流動相污染或變質(zhì):引起保留時間變化，重新配置流動相。

　　3、保護柱或分析柱阻塞:去掉保護柱進行分析，如果必要則更換保護柱；如果分析柱阻塞，可進行反沖；如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞，建議使用恰當?shù)脑偕绦?；如果問題仍然存在，進口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。